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商用高效液相色譜系統(tǒng)已有40多年的歷史。在此期間，出現(xiàn)了各種各樣的技術(shù)進(jìn)步，如高精度低流量蠕動(dòng)泵、具有良好再現(xiàn)性的進(jìn)樣器和能夠進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)的各種類型的探測(cè)器。然而，因此，化學(xué)因素在決定高靈敏度分析或自動(dòng)連續(xù)分析是否具有高可靠性方面變得越來越重要。例如，這包括諸如樣品組分的吸附和穩(wěn)定性，流動(dòng)相(或洗脫液)的選擇，或在制備過程中解決重現(xiàn)性問題等因素?，F(xiàn)在還需要關(guān)注流動(dòng)相中的溶解空氣水平如何影響探測(cè)器基線穩(wěn)定性或探測(cè)靈敏度。在流動(dòng)相中調(diào)整溶解空氣的水平可視為流動(dòng)相脫氣問題。因此，這篇專題文章通過從理論原理到實(shí)際實(shí)踐的一系列問題，將重點(diǎn)放在了流動(dòng)相的脫氣問題上。我希望本文將有助于您選擇和使用適合的脫氣方法。

　　1.由于流動(dòng)相中的空氣可能發(fā)生的各種問題

　　為了再次強(qiáng)調(diào)流動(dòng)相脫氣的重要性，下面的例子展示了由于流動(dòng)相中的空氣而可能發(fā)生的問題。這些問題可以通過適當(dāng)?shù)拿摎鈦斫鉀Q。

　　這些問題大致可以分為與氣泡形成有關(guān)的問題和與溶解空氣有關(guān)的問題，沒有氣泡形成。

　　我們還收到了關(guān)于溶解氧引起問題的報(bào)告，例如樣品組分、流動(dòng)相中的化合物和固相的氧化，但遺憾的是，這種討論不在本文的討論范圍之內(nèi)。

　　2.氣泡產(chǎn)生的機(jī)理

　　現(xiàn)在，讓我們來確認(rèn)氣泡是如何形成的。當(dāng)溶液中溶解的空氣量超過飽和溶解度時(shí)，就會(huì)形成氣泡。飽和溶解度是當(dāng)溶液暴露在空氣中，進(jìn)入和離開溶液的空氣處于平衡狀態(tài)時(shí)，最終溶解在溶液中的空氣量。然而，這個(gè)量取決于溶液的類型、氣體的類型、溫度和壓力。

　　因此，科學(xué)地講，這是用這樣的方式表示“鑒于氧氣接觸水的分壓在25℃是0.2個(gè)大氣壓，氧的飽和溶解度在25℃和一個(gè)大氣壓下是1毫升的水含有0.006毫升氧氣?！?/p>

　　如果溶解的氣體超過飽和溶解度，則稱為過飽和，在振動(dòng)或攪拌時(shí)容易產(chǎn)生氣泡。相反，在飽和溶解度水平以下，空氣很容易溶解到溶液中，但這種溶解速度不是很快。

　　2-1)升高溶液溫度

　　在某些情況下，例如，當(dāng)一種因儲(chǔ)存而變冷的溶劑被放在一個(gè)溫暖的房間里時(shí)，氣體的飽和溶解度隨著溫度的升高而逐漸降低，導(dǎo)致過量的溶解氣體形成氣泡。這是同樣的原理，當(dāng)軟飲料在打開之前加熱時(shí)，二氧化碳?xì)怏w(CO2)會(huì)更劇烈地形成。

　　圖2顯示了在某一大氣壓下，O2和N2相對(duì)于水的飽和溶解度曲線。由于實(shí)際空氣中含有20%的O2和78%的N2，如果暴露在空氣中，溶解的O2和N2分別是所示水平的0.2或0.8倍左右。

　　2-2)減少壓力

　　一般來說，氣體壓力(分壓)越高，氣體溶入液體的程度就越高(圖3)。相反，如果在高壓下溶解了飽和的氣體，當(dāng)壓力降低時(shí)，氣泡就會(huì)形成。

　　2-3) 溶劑混合

　　氣體的飽和溶解度因液體的種類而異。通常，極性較低的氣體在極性較低的溶劑中更容易溶解。圖4顯示，苯和甲醇每體積溶解的氣體大致相同。如果用每摩爾溶劑的溶解量，也就是摩爾分?jǐn)?shù)來計(jì)算，很明顯，溶劑的極性越低，溶解速率越高。

　　如果不同的溶劑混合，那么飽和溶解度會(huì)發(fā)生什么變化?答案是，一般來說，混合溶液中溶解的量小于單個(gè)溶劑中溶解量的總和。圖5顯示了水和乙醇的混合物(在1大氣壓下)中溶解的O2的數(shù)量。點(diǎn)A表示100%水中溶解O2的量，點(diǎn)B表示100%乙醇中溶解O2的量。當(dāng)混合等量的水和乙醇時(shí)，溶液中含有與點(diǎn)C相對(duì)應(yīng)的O2，但該溶液的飽和溶解度僅在點(diǎn)D處，因此，點(diǎn)C與點(diǎn)D之間的O2的差值為氣泡。水/甲醇和水/乙腈混合物的飽和溶解度也是如此。

　　如果混合的兩種溶劑都是水，甚至也會(huì)產(chǎn)生氣泡。這是因?yàn)榭諝獾娘柡腿芙舛韧ǔｋS鹽濃度的增加而降低。然而，這種關(guān)系不是線性的，而是向下彎曲的。

　　3. 在流路中形成氣泡的問題

　　3-1) 由于流動(dòng)相瓶?jī)?nèi)產(chǎn)生氣泡而引起的溶劑輸送問題

　　現(xiàn)在，讓我們通過在第1節(jié)中介紹的，第2節(jié)中機(jī)理的描述重新考慮流動(dòng)管道中氣泡形成的問題。

　　如果在流動(dòng)相瓶中形成氣泡，則表明流動(dòng)相已被溶解空氣過飽和。例如，這可能是由以下原因引起的:

　?。?）液體溫度升高

　　當(dāng)使用從儲(chǔ)存中取出的冷溶劑并立即放入流動(dòng)相瓶時(shí)，或者在早上裝配流動(dòng)相，但中午室溫升高時(shí)，就會(huì)發(fā)生這種情況。

　　（2）溶劑混合物的混合不足

　　特別是水與乙腈混合時(shí)的吸熱反應(yīng)會(huì)降低溶液溫度。因此，即使溶液完全混合以除去任何過飽和的空氣，如果被室溫加熱并使其溫度升高，氣泡仍然會(huì)發(fā)生。

　　如果這些氣泡通過吸入過濾器吸進(jìn)泵頭，溶劑將不能再正常輸送。首先，當(dāng)氣泡上升時(shí)，泵頭內(nèi)部較低的壓力導(dǎo)致氣泡膨脹(圖7)。當(dāng)這種情況發(fā)生時(shí)，柱塞測(cè)量溶劑的體積和膨脹氣泡的體積。接下來，當(dāng)溶劑被噴出時(shí)，頭部?jī)?nèi)部的高壓會(huì)收縮氣泡。這意味著比正常量的流動(dòng)相的輸送要少。這樣，如果允許氣泡不受限制地流過泵頭，流動(dòng)相的輸送量也將不受限制(溶劑輸送準(zhǔn)確度和精密度較差)。這種現(xiàn)象的存在可以通過監(jiān)測(cè)(圖8)溶劑輸送泵的流出壓力曲線來確定。如果出現(xiàn)這種類型的問題，保留時(shí)間和峰值面積的變異性會(huì)增加(圖9)，分析結(jié)果沒有充分的可靠性。

　　3-2) 因泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡導(dǎo)致溶劑輸送發(fā)生故障

　　即使流動(dòng)相瓶中溶解的空氣低于飽和溶解度水平，當(dāng)溶液通過泵時(shí)仍會(huì)形成氣泡。

　　(1)低壓梯度混合：當(dāng)不同的溶劑在常壓下(或稍低的壓力下)混合時(shí)，由2-3所述的機(jī)理，圖10中紅色圓圈區(qū)域會(huì)形成氣泡。無論梯度混合器安裝在泵下游(高壓側(cè))多遠(yuǎn)，混合將在紅色圓圈區(qū)域開始，這在一定程度將導(dǎo)致的氣泡形成。相反，在高壓梯度混合中，從泵下游(高壓側(cè))開始混合，所以不會(huì)出現(xiàn)這種問題。

　　(2) 吸濾器堵塞：如果吸入過濾器堵塞，在吸入過程中阻力增加，增加了由于過濾器內(nèi)壓力下降而形成氣泡的可能性。當(dāng)過濾器閑置時(shí)，雜質(zhì)附著在過濾器上，或者甲醇通過過濾器時(shí)，沒有意識(shí)到之前的流動(dòng)相是緩沖溶液時(shí)，就會(huì)發(fā)生堵塞。如果堵塞的程度很輕，可以通過適當(dāng)?shù)厝コ鲃?dòng)相中的氣體來防止氣泡，但實(shí)際上應(yīng)該通過清洗或更換過濾器來解決這個(gè)問題。

　　這些因素引起的問題與3-1中描述的一樣。

　　如何清洗吸濾器

　　如果吸入過濾器被不溶物或碎片堵塞，嘗試用超聲波清洗機(jī)反流沖洗，如圖11所示。如果化合物沉淀堵塞，清洗過濾器通過切換清洗解決方案，從水到溶液A，到異丙醇、氯仿(A是稀氨水/甲醇溶液的酸性有機(jī)化合物或稀釋水磷酸/甲醇溶液的堿性有機(jī)化合物)。另外，使用泵徹底清洗(圖12)。即使清洗后，如果在快速流動(dòng)過程中吸入管中出現(xiàn)氣泡，也要更換過濾器。

　　請(qǐng)注意，稀硝酸溶液(不要讓它接觸酒精)經(jīng)常用作金屬顆粒的洗滌溶液，而EDTA-2Na溶液經(jīng)常用于金屬離子，SDS溶液經(jīng)常用于蛋白質(zhì)。

　　3-3) 由于氣泡在柱內(nèi)形成或聚集而形成的溝道

　　由于壓力的增加，增加了空氣的飽和溶解度，氣泡往往不會(huì)在柱內(nèi)出現(xiàn)。然而，如果用柱溫箱加熱，在柱出口附近相對(duì)較低的壓力區(qū)域會(huì)形成氣泡。氣泡通過泵后也有可能聚集在這個(gè)區(qū)域。

　　這種情況會(huì)導(dǎo)致柱中的流動(dòng)相流動(dòng)發(fā)生變化，導(dǎo)致峰結(jié)果失真。

　　注意，柱直徑越大，氣泡出柱的難度越大。因此，如果在高效液相色譜系統(tǒng)上附加了一個(gè)預(yù)備柱，則安裝該柱，使進(jìn)氣口盡可能高，出氣口盡可能低，以盡量減少因克服浮力而產(chǎn)生的氣泡。

　　3-4) 檢測(cè)池內(nèi)氣泡形成或聚集引起的基線噪聲

　　如果對(duì)柱或檢測(cè)器單元加熱，氣泡更容易形成，因?yàn)橥ㄟ^檢測(cè)池的溶液溫度升高，壓力接近大氣壓。此外，氣泡可以在梯度系統(tǒng)中形成，甚至不需要加熱。第2-3節(jié)描述了溶劑混合時(shí)飽和溶解度如何降低。例如，在高壓梯度混合的情況下，混合后的流線保持在高壓下，這抑制了氣泡的形成，但氣泡可以在壓力接近大氣壓的單元中形成。

　　檢測(cè)器池中氣泡的形成或積累可能導(dǎo)致尖刺和鋸齒噪聲，或?qū)е禄€波動(dòng)超出范圍。因此，它可以防止峰和噪聲的區(qū)分，導(dǎo)致基線位置的不確定性，并防止峰被正確地積分。

　　在3-3)和3-4)中描述的情況下，如果使用紫外線或電導(dǎo)檢測(cè)器，電池的抗壓性很高(12mpa和3mpa)。因此，可以通過對(duì)檢測(cè)器出口施加反壓力并增加柱出口和單元內(nèi)的壓力來防止氣泡的形成。通常情況下，背壓采用2米長(zhǎng)的不銹鋼管，內(nèi)徑0.3毫米，作為流量限制器連接。當(dāng)水或甲醇以1mL /min的速度流過節(jié)流器時(shí)，分別會(huì)產(chǎn)生0.2 MPa和0.1 MPa的壓力。不同溶劑壓力不同的原因是溶劑粘度不同，其影響如下式所示。

　　(壓力)∝(溶劑粘度)(流量)(管長(zhǎng)度)(層流通過管提供了持續(xù)的內(nèi)部直徑)

　　如果在制備流量下使用，同樣的節(jié)流管會(huì)施加過多的壓力。在這種情況下，必須使用較短的管或內(nèi)徑較大的管(例如0.8毫米)。另一方面，對(duì)于半微LC或其他低流量應(yīng)用(例如0.1 mL/min)，相同的節(jié)流管施加的壓力太小。因此，這需要切換到一個(gè)能夠更容易施加反壓力的管子，例如一個(gè)6米長(zhǎng)的內(nèi)徑0.2毫米的管子。

　　然而，由于流通池的低壓阻力，反壓不能應(yīng)用于電化學(xué)檢測(cè)器。在這種情況下，溶解的空氣必須事先從流動(dòng)相中除氣。

　　根據(jù)流動(dòng)線中氣泡形成的問題，討論了溫度升高、壓力降低、混合溶劑等關(guān)鍵因素。圖15顯示了流線、壓力和溫度之間關(guān)系的示例。請(qǐng)使用它來評(píng)估系統(tǒng)的哪個(gè)區(qū)域最有可能產(chǎn)生氣泡。

　　4 .溶解空氣(氧)對(duì)檢測(cè)的有害影響

　　通過檢查氣泡產(chǎn)生壓力的波動(dòng)、氣泡基線的特征噪聲等，很容易發(fā)現(xiàn)氣泡形成的相關(guān)問題。然而，一個(gè)難以注意到的更麻煩的問題是不形成氣泡的溶解空氣的有害影響。

　　4-1) 高濃度的溶解氧對(duì)檢測(cè)結(jié)果有不利影響

　　在所有溶解氣體中，氧對(duì)檢測(cè)的影響最大。溶解氧在不同的壓力/溫度條件下，甚至在低于飽和溶解度的水平下，都能在探測(cè)器流通池內(nèi)部引起各種各樣的問題。

　　i)熒光檢測(cè)器：當(dāng)溶解氧水平較高時(shí)，對(duì)某些熒光成分如芘、萘和其他多環(huán)芳烴或生育酚(維生素E)的檢測(cè)響應(yīng)會(huì)降低(O2猝滅)。在實(shí)際應(yīng)用中，溶劑背景濃度也有所下降，但響應(yīng)下降幅度較大。例如，除去溶解氧后，萘的響應(yīng)大約是響應(yīng)的1/4。

　　ii) 電化學(xué)檢測(cè)器：特別是如果測(cè)量值低于還原電位，高水平的溶解氧會(huì)產(chǎn)生不利于S/N比的還原電流。

　　4-2) 高濃度或不斷變化的溶解氧對(duì)紫外線檢測(cè)的有害影響

　　對(duì)于一些有機(jī)溶劑，如果溶解氧水平高，吸光度明顯增加。相反地，它意味著脫氣可以降低由于吸收流動(dòng)相引起的背景的水平。例如，如果用溶解飽和空氣(其中氧的分壓為0.2大氣壓)的甲醇作為流動(dòng)相，并在210 nm處測(cè)量，與通過氦氣凈化除空氣后相比，背景可以減少超過0.32 AU(圖16)。因此，如果溶解氧水平高，不用說噪音水平高，但如果移動(dòng)相溫變化或其他因素可以改變?nèi)芙庋跛剑€波動(dòng)也會(huì)增加。如果測(cè)量范圍為0.01 AU，溶解氧的1%變化會(huì)導(dǎo)致基線變化超過30%。與溶解氧水平高的甲醇梯度混合會(huì)增加基線斜率(圖17)，可能會(huì)出現(xiàn)積分問題。

　　溶解氧的這種作用在短波長(zhǎng)的區(qū)域是顯著的，但是已經(jīng)證實(shí)對(duì)四氫呋喃(THF)可以延伸到相對(duì)長(zhǎng)的波長(zhǎng)。在254nm處的相對(duì)效應(yīng)用不等式THF >甲醇>乙腈>水表示。相比之下，這種效應(yīng)對(duì)于乙腈(色譜級(jí))即使在短波長(zhǎng)的情況下也不會(huì)出現(xiàn)。因此，吸光度的增加似乎不是由于氧氣本身的吸收，而是由于氧氣與溶劑或溶劑中的雜質(zhì)之間某種獨(dú)特的相互作用。

　　一般來說，色譜級(jí)乙腈應(yīng)用于短紫外波長(zhǎng)區(qū)域的高靈敏度分析。然而，如果由于分離選擇性而必須使用甲醇或四氫呋喃，則將溶液脫氣以降低溶解氧水平，并使其保持在恒定水平。

　　4-3)由于溶解空氣含量的變化，折光儀基線的波動(dòng)

　　液體的折射率不僅取決于固體和液體的溶解，也取決于氣體的溶解。因此，由于液體溫度的變化，導(dǎo)致空氣溶解度的變化會(huì)使得折光儀基線漂移或波動(dòng)。如果測(cè)量與四氫呋喃作為流動(dòng)相，8×10 -6 RIU的滿量程范圍，溶解氧變化1%，基線變化超過10%的滿量程范圍。適當(dāng)?shù)募m正措施包括通過保持流動(dòng)相溫度恒定來抑制溶解變化，或者用氦凈化空氣，氦的溶解水平與溫度的關(guān)系最小。

　　如上文第4節(jié)所述，在進(jìn)行分析時(shí)，請(qǐng)記住溶解空氣(氧)對(duì)檢測(cè)可能產(chǎn)生的有害影響。

　　5.脫氣方法

　　到上一節(jié)為止，我們展示了需要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行脫氣的示例，但本節(jié)討論了用于除氣的方法。脫氣有兩種基本方法：離線脫氣和在線脫氣。

　　離線脫氣在將流動(dòng)相置于泵進(jìn)口之前，先將其除氣。然而，流動(dòng)相一旦被放置在泵入口，就開始重新溶解空氣，因此徹底脫氣幾乎沒有意義。相比之下，在在線除氣中，即使在分析過程中也會(huì)繼續(xù)除氣。它的處理有點(diǎn)耗時(shí)，但在提高分析的可靠性方面更有效。每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，如下所示。

　　5-1) 加熱攪拌（1）

　　通過加熱攪拌，將流動(dòng)相瓶中溶解的空氣降低到飽和溶解度水平。如果儲(chǔ)存過程中使用的是冷溶劑，而且在分析過程中溫度預(yù)計(jì)會(huì)從早上上升到中午，或者水和乙腈混合，那么稍微加熱一下就會(huì)使其更快達(dá)到平衡。當(dāng)液體溫度較低時(shí)，液體密度會(huì)不同(增加)，這也會(huì)影響溶劑的輸送。消除這種效應(yīng)也是加熱攪拌的目的之一。

　　無論是使用氣液分離膜在線脫氣，還是通過氦氣凈化脫氣，提前完成這個(gè)過程都是可取的。

　　程序

　　將流動(dòng)相瓶放在比室溫稍微暖和一點(diǎn)的水浴中，蓋子松開。偶爾打開瓶蓋，固定瓶蓋，搖勻，然后松開瓶蓋釋放多余的氣體。這與減壓分離漏斗完全相同。當(dāng)瓶子溫度略高于室溫時(shí)，這個(gè)過程就完成了。擦拭瓶壁并將其放在泵進(jìn)口處。

　　優(yōu)點(diǎn)

　　-該工藝簡(jiǎn)單，無需特殊設(shè)備。

　　缺點(diǎn)

　　-除氣只有在達(dá)到飽和溶解度水平時(shí)才能進(jìn)行，因此不能用于低壓梯度或其他一些高靈敏度檢測(cè)方法。

　　-如果過熱，過度的脫氣會(huì)在分析過程中由于空氣重新溶解而引起基線漂移。

　　應(yīng)用

　　-用紫外、折射或熒光檢測(cè)進(jìn)行正常靈敏度的分析。但是，如果使用柱溫箱、檢測(cè)器單元加熱或高壓梯度，則必須對(duì)檢測(cè)器施加反壓力。請(qǐng)注意，最好保持移動(dòng)相瓶抬高或額外使用一個(gè)氣泡陷阱，如后5-6)。

　　5-2) 使用脫氣器進(jìn)行真空除氣

　　這種方法也可以用來快速去除多余溶解的空氣。

　　程序

　　將抽濾器連接到移動(dòng)相瓶口上，并通過使用超聲波清洗機(jī)振動(dòng)瓶或攪動(dòng)流動(dòng)相的方式吸氣。當(dāng)小氣泡的劇烈起泡停止時(shí)，這個(gè)過程就結(jié)束了。如果吸入太多，大氣泡形成或流動(dòng)相沸騰。在吸入過程中，由于與液體接觸的氣體越來越多是流動(dòng)相蒸發(fā)(由于空氣的分壓接近于零)，溶解空氣的含量很容易在飽和溶解度水平以下脫氣。另一方面，如果把瓶子放在泵入口，與液體接觸的氣體逐漸被空氣所取代，空氣開始重新溶解。同時(shí)，在吸氣過程中，流動(dòng)相汽化的熱量丟失，容易冷卻。在這種情況下，瓶子放置在泵入口后溶液溫度升高，與前面描述的相反，飽和溶解度可能降低。

　　優(yōu)點(diǎn)

　　-快速脫氣

　　缺點(diǎn)

　　-過低的壓力會(huì)改變?nèi)軇┑慕M成。

　　-折光計(jì)和一些紫外檢測(cè)器的基線容易漂移

　　應(yīng)用

　　-使用紫外或熒光檢測(cè)的正常靈敏度分析。但是，如果使用柱溫箱、檢測(cè)器流通池加熱或高壓梯度，則必須對(duì)檢測(cè)器施加反壓力。

　　-由于液體溫度變化或溶劑成分變化的可能性，不適合進(jìn)行高精度分析。

　　-如果使用電導(dǎo)檢測(cè)或電化學(xué)檢測(cè)，僅以水為流動(dòng)相溶劑，在飽和溶解度水平以下過度脫氣，可以進(jìn)行數(shù)小時(shí)的分析。

　　5-3) 加熱攪拌（2）

　　這種方法采用在線加熱。由于它可以將流動(dòng)相加熱到與柱或檢測(cè)器流通池相同的溫度，如果提供了具有固定成分的溶劑，就不會(huì)形成氣泡，折光計(jì)基線就會(huì)穩(wěn)定。流動(dòng)相溫度越高，除氣能力越高，但要求防止沸騰氣泡進(jìn)入吸濾器，加熱或控制吸入管和泵頭溫度。

　　程序

　　將冷凝器連接到專用的儲(chǔ)液瓶上，并將其置于熱攪拌器上。為了改善溫度控制，應(yīng)該使用暖水浴。

　　優(yōu)點(diǎn)

　　-空氣溶解的水平非常穩(wěn)定

　　缺點(diǎn)

　　-設(shè)備體積龐大，需要一個(gè)帶有專用止水器和水線的移動(dòng)相瓶。

　　-對(duì)于溶劑混合物，溶劑混合比誤差可能發(fā)生在制備和輸送階段之間。

　　-穩(wěn)定需要時(shí)間

　　-運(yùn)營(yíng)成本高

　　應(yīng)用

　　-使用折光計(jì)、電導(dǎo)檢測(cè)或電化學(xué)檢測(cè)器進(jìn)行高靈敏度分析。

　　-適用于高溫加熱時(shí)使用紫外線或熒光檢測(cè)進(jìn)行高靈敏度分析。

　　5-4)使用氣液分離膜進(jìn)行真空脫氣

　　這種脫氣裝置安裝在流動(dòng)相瓶和溶劑輸送泵之間，用途廣泛，一般稱為脫氣單元。這些脫氣單元在樹脂膜管外部保持真空壓力，并利用膜的滲透性從流動(dòng)相溶液中去除較小的分子，如氧和氮。因?yàn)樗鼈兡軌蛉コ蠹s70%-95%的空氣，它們能夠防止在流線中產(chǎn)生氣泡的問題，甚至適合梯度洗脫，它們適合于某些高靈敏度的檢測(cè)方法。

　　程序

　　將脫氣單元連接到流動(dòng)相瓶和輸送泵。通過泵排泄，排出樹脂膜管容量的2-3倍(型號(hào)DGU-3A/4A每跟管路約15 mL，型號(hào)DGU-12A/14A每跟管路約10 mL，型號(hào)DGU-12AM/14AM每跟管路約2mL)。另一種方法是，當(dāng)廢水被排干時(shí)，用抽吸濾器將氣泡吸出液體表面約5秒鐘，然后等待氣泡排干。氣泡停止排放后，繼續(xù)排放約10 mL，然后完成流動(dòng)相置換。

　　優(yōu)點(diǎn)

　　-不限制流動(dòng)相瓶形狀或瓶塞(其他在線除氣方法有限制)。

　　-流動(dòng)相混合物的組成不太可能改變。

　　-運(yùn)營(yíng)成本低。

　　-處理是容易的。

　　缺點(diǎn)

　　-脫氣能力取決于流量。*1

　　-真空泵開啟或關(guān)閉時(shí)，脫氣能力不同。*2

　　*1:

　　脫氣能力隨流量的增大而減小。因此，如果在210nm監(jiān)測(cè)100%甲醇流動(dòng)相，當(dāng)流量增加時(shí)吸光度會(huì)增加(圖23，使用型號(hào)DGU-3A/4A)。在水/甲醇高壓線性梯度分析中，基線吸光度的變化為一條曲線(圖24)。

　　*2:

　　有三種類型的脫氣單元-(1)帶有真空泵的模塊，并以恒定的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)，(2)帶有真空泵的模塊，當(dāng)真空室內(nèi)的真空度達(dá)到一定水平后關(guān)閉真空泵，然后自動(dòng)啟動(dòng)當(dāng)真空度降低時(shí)，和(3)帶有真空泵的模塊，真空泵在很小的固定間隔里進(jìn)行開關(guān)。類型(1)的型號(hào)需要很長(zhǎng)時(shí)間才能穩(wěn)定下來，而且不會(huì)賣出太多。到目前為止，很多型號(hào)都是類型(2) (DGU-3A/4A)。在某些情況下，(2)型脫氣裝置可在210 nm處用于甲醇紫外檢測(cè)或254 nm處用于THF折光計(jì)檢測(cè)中引起基線波動(dòng)(圖25)。近年來，出現(xiàn)了類型(3)模型(DGU-12A/14A)，其波動(dòng)小得多。對(duì)于折光計(jì)，有時(shí)可以通過串聯(lián)脫氣裝置的多條流線來減少波動(dòng)(圖26)。

　　應(yīng)用

　　-采用低壓或高壓梯度混合的高精度(保留時(shí)間的重現(xiàn)性)分析

　　-使用熒光檢測(cè)、電導(dǎo)檢測(cè)或電化學(xué)檢測(cè)的高靈敏度分析

　　-利用紫外線檢測(cè)進(jìn)行高靈敏度分析。但是，如果使用溶解氧水平波動(dòng)顯著影響吸光度的流動(dòng)相，這種方法就不適用。

　　-用折光檢測(cè)器進(jìn)行的常規(guī)靈敏度分析。

　　5-5) 通過氦氣脫氣

　　將氦氣通入流動(dòng)相會(huì)使氦溶解并取代溶解的空氣。如圖27所示，氦在各溶劑中的溶解度普遍較低，且受溫度影響較小，如圖28所示。因此，它不僅有助于在紫外線和熒光檢測(cè)(這是受溶解氧的高度影響)而且有助于折射計(jì)檢測(cè)器的情況下獲得高靈敏度穩(wěn)定的基線。這種方法被稱為氦吹掃法、氦氣鼓泡法或噴霧法。

　　然而，即使流動(dòng)相瓶被氦氣吹掃，如果瓶子被放在空氣中，它也會(huì)引起額外的基線不穩(wěn)定性。原因是與液體接觸的氣體總是含有空氣，所以不可能完全排除空氣。此外，改變氦氣流量也會(huì)導(dǎo)致空氣的分壓波動(dòng)，從而導(dǎo)致基線漂移。因此，當(dāng)用氦氣吹氣時(shí)，最好使用密封加壓系統(tǒng)。

　　程序

　　密封加壓氦氣吹掃需要如圖29所示的流線配置。其中一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是流動(dòng)相瓶的專用密封帽(包括DGU-10A等型號(hào)的標(biāo)準(zhǔn))。首先，首先將氦氣提高流量(例如，通過壓力將其調(diào)整為0.02至0.05 MPa或0.2至0.5 kgfcm-2)，保持10至30分鐘，以清除流動(dòng)相中的空氣。接下來，關(guān)閉排氣閥門，對(duì)與液體接觸的氣體稍微加壓。這時(shí)候，流動(dòng)相已經(jīng)準(zhǔn)備好可以進(jìn)行分析。然后，提供足夠的氦氣來補(bǔ)償泵輸送流動(dòng)相中的液滴。

　　分析完成后，打開放氣閥，將壓力調(diào)節(jié)閥調(diào)零或關(guān)閉閥門(如果有的話)。由于氦氣逐漸從氦氣管中逸出(這使得空氣難以進(jìn)入管內(nèi)并在管內(nèi)產(chǎn)生真空壓力)，有時(shí)流動(dòng)相可以回流出氦氣過濾器。如果節(jié)流管在裝置內(nèi)部有泄漏，這個(gè)問題可以通過空氣回流來避免。如果不可用，通過松開氦氣輸出管和裝置之間的連接來引入空氣。

　　當(dāng)調(diào)節(jié)閥失效或壓力設(shè)置過高時(shí)，裝置中的安全閥可以讓氦氣逸出，以防止流動(dòng)相瓶?jī)?nèi)的壓力過大。當(dāng)然，為了最大限度的安全，流動(dòng)相瓶應(yīng)該用塑料片或網(wǎng)包裝(圖30)。(DGU-10A型號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)型號(hào)包括塑料片和網(wǎng)。)

　　溶劑氣體疏水閥用于防止揮發(fā)性溶劑蒸汽擴(kuò)散到室內(nèi)。然而，對(duì)于沒有密封和加壓的氦氣凈化系統(tǒng)，它們也可以在保持氣體與液體接近恒定壓力下保持接觸的情況下發(fā)揮作用。

　　優(yōu)點(diǎn)

　　-顯示出最佳的除氣能力。

　　-除氣能力不依賴于溶劑輸送流量。

　　缺點(diǎn)

　　-需要一個(gè)氦氣瓶，調(diào)節(jié)器和氣體管路。

　　-除非使用密封加壓系統(tǒng)，否則可能無法維持穩(wěn)定的基線。因此，流動(dòng)相瓶的尺寸和形狀都有限制。

　　-對(duì)含有揮發(fā)性溶劑的流動(dòng)相進(jìn)行脫氣時(shí)可以改變?nèi)軇┑慕M成。(使用密封加壓系統(tǒng)使系統(tǒng)穩(wěn)定后，不太可能發(fā)生成分變化。)

　　應(yīng)用

　　-高靈敏度的紫外線和所有其他檢測(cè)方法的分析(給定一個(gè)密封加壓系統(tǒng))。(對(duì)于開放系統(tǒng)，氦吹掃可用于熒光、電導(dǎo)率或電化學(xué)檢測(cè)的高靈敏度分析。)

　　-使用低壓或高壓梯度混合的分析(如果將單一溶劑放入單個(gè)流動(dòng)相瓶中，則可以進(jìn)行高精度分析)。

　　5-6) 無脫氣方法

　　雖然它們不是脫氣方法，但將流動(dòng)相瓶放置得更高，并安裝一個(gè)氣泡阱，可能會(huì)減少氣泡流入溶劑輸送泵。

　　提升流動(dòng)相瓶

　　將流動(dòng)相瓶抬高至溶劑輸送泵之上，如圖31所示。這對(duì)泵進(jìn)口施加一點(diǎn)壓力，可以減少內(nèi)回流止回閥的故障(如果回流止回閥正常工作，則與此無關(guān))，在一定程度上壓縮進(jìn)入泵進(jìn)口的任何氣泡，并提供其他好處。浮力也使吸入管中的小氣泡更難進(jìn)入泵內(nèi)。

　　由于提高流動(dòng)相瓶有很多好處，我們建議提高流動(dòng)相的放置位置即使使用在線脫氣單元。

　　氣泡捕捉器

　　在流動(dòng)相瓶和溶劑輸送泵之間可安裝氣泡捕捉器(圖32和33)，防止氣泡通過吸入管進(jìn)入溶劑輸送泵。要將流動(dòng)相引入疏水閥(從疏水閥中吸出氣泡)，并將注射器連接到注射器端口。

　　這種方法的缺點(diǎn)包括(1)更換流動(dòng)相需要時(shí)間(需要至少10到20次的內(nèi)部體積液體通過捕捉器)，(2)它不能用于在入口進(jìn)行低壓梯度混合的系統(tǒng)(因?yàn)樗柚箘?chuàng)建適當(dāng)?shù)奶荻?，和其他因素。因此，如果使用在線除氣裝置，使用捕捉器是沒有意義的。

　　6.特定分析條件的應(yīng)對(duì)措施

　　前幾節(jié)討論了特定流動(dòng)相除氣方法的特點(diǎn)和應(yīng)用。本節(jié)根據(jù)分析條件來考慮脫氣。一般來說,對(duì)于靈敏度正常水平的通過加熱攪拌(5-1中描述)和提升流動(dòng)相(5-6中描述)通常是足夠的，但在許多情況下，例如如果檢測(cè)條件不同或如果需要穩(wěn)定的高靈敏度基線，就必須要考慮在線脫氣或其他非脫氣措施。

　　6-1) 在反相色譜柱和紫外短波長(zhǎng)條件下如何獲得高靈敏度的基線

　　利用ODS或其他反相色譜柱使用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)是HPLC分析中最常用的組合。但是，要實(shí)現(xiàn)短波長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)的高靈敏度檢測(cè)，必須考慮以下幾點(diǎn)。

　?。?）徹底沖洗高效液相色譜的流路和色譜柱

　　簡(jiǎn)單地用流動(dòng)相沖洗一天是浪費(fèi)時(shí)間。一種更有效的沖洗方法是對(duì)被沖洗的特定物質(zhì)使用溶解性高于流動(dòng)相的沖洗溶液。例如，要沖洗油基物質(zhì)或高度疏水的中性物質(zhì)，可以試試四氫呋喃。對(duì)于吸附在硅膠表面的物質(zhì)，使用0.01%含甲醇/0.5 M高氯酸鈉(1:4)的磷酸水溶液。對(duì)于金屬離子，使用0.1%的EDTA-2Na水溶液(不通過柱)。通過多次切換每個(gè)閥門的位置沖洗管路開關(guān)閥，包括進(jìn)樣器。以及沖洗吸入過濾器。

　　對(duì)于其他高靈敏度分析，也應(yīng)考慮流線和柱沖洗措施。

　?。?）使用低背景水平的試劑作為流動(dòng)相

　　圖34-36為乙腈、甲醇和THF試劑的吸收光譜，這些試劑通常用于反相柱的流動(dòng)相。結(jié)果表明，色譜級(jí)乙腈在短波長(zhǎng)區(qū)背景電平最低。而甲醇和THF試劑的背景水平較高，會(huì)增加噪聲，背景水平隨著溶解氧水平的變化而變化。因此，它們不適合進(jìn)行高靈敏度分析。根據(jù)溶劑類型的不同，分離選擇性和峰形也會(huì)有所不同，但如果穩(wěn)定性不太好，應(yīng)使用色譜級(jí)乙腈。

　　此外，使用乙酸或其他有機(jī)酸作為緩沖溶液或使用胺基吸附抑制劑，如三乙胺，可以增加背景水平。緩沖溶液采用磷酸鈉溶液(吸附抑制劑采用高氯酸鈉溶液)，必要時(shí)只制備必要數(shù)量的流動(dòng)相。當(dāng)然，對(duì)于水，使用色譜級(jí)蒸餾水。

　?。?）使用高靈敏度的檢測(cè)器

　　顯然，在市面上的LC檢測(cè)器中，使用的是噪音水平越低越好。

　?。?）在線脫氣

　　即使使用色譜級(jí)乙腈，密封加壓氦氣凈化系統(tǒng)或其他類型的在線脫氣系統(tǒng)也可以提供輕微的背景水平降低。

　　我們前面只指出了四點(diǎn)，是按重要性排序的，但實(shí)際上，最常見的是(1)和(2)兩點(diǎn)不滿足適當(dāng)?shù)臈l件。因此，也要考慮分析條件。

　　(色譜級(jí)蒸餾水分別用于空氣飽和和對(duì)照。)

　　6-2) 如何使糖分析柱和折光計(jì)獲得高靈敏度的基線

　　盡管紫外檢測(cè)得到了廣泛的應(yīng)用，但折射計(jì)通常用于糖分析和GPC(或SEC  -體積排阻色譜)。一般認(rèn)為折射計(jì)的基線穩(wěn)定性較差，但真正的罪魁禍?zhǔn)淄橇鲃?dòng)相中溶解空氣或柱溫度變化。

　　i)配體交換色譜柱(如Shim-PackSCR-101P)

　　為了獲得尖峰可以使用這種類型的列，分析柱的溫度必須設(shè)置接近80℃。因此，即使流動(dòng)相瓶中的溶解空氣處于飽和溶解度，氣泡也很容易在柱出口附近或下游形成。如果發(fā)生這種情況，(1)提前進(jìn)行在線脫氣以降低溶解的空氣水平或(2)施加背壓以抑制氣泡的形成。然而，對(duì)于測(cè)量(2)，折射計(jì)不能承受很大的背壓。如果傳輸水0.8 mL/min，然后假設(shè)限制0.3毫米的直徑×50厘米(相當(dāng)于0.04 MPa或0.4 kgcm-2)(假設(shè)沒有堵塞，流經(jīng)樣品室)的解決方案。在這種情況下，在折射計(jì)之前安裝一個(gè)節(jié)流管。

　　典型分析條件如下：

　　Column: Shim-packSCR-101P (7.9 mm I.D. × 300 mm L)

　　Mobile Phase:Water

　　Flow_rate: 0.8mL/min

　　ColumnTemperature: 80 °C

　　Detector: RID-6ARefractive Index Detector (with temperature control ON and sensitivity of 2 ×10-6 RIUFS)

　　如果只用水作為流動(dòng)相，溶解空氣含量的波動(dòng)對(duì)折射率的變化影響不大。因此，如果檢測(cè)池內(nèi)沒有形成氣泡，那么配體交換柱可能可以用于上述靈敏度水平，而無需嚴(yán)格的脫氣。

　　ii) 正相色譜柱（如Shim-packCLC-NH2）

　　典型分析條件如下：

　　Column: Shim-packCLC-NH2 (6 mm I.D. × 150 mm L)

　　Mobile Phase:Acetonitrile/water (7/3)

　　Flow_rate: 1.2mL/min

　　ColumnTemperature: Room temperature

　　Detector: RID-6ARefractive Index Detector (with temperature control ON and sensitivity of 8 ×10-6 RIUFS)

　　在這些條件下，在準(zhǔn)備流動(dòng)相時(shí)要特別小心。在梯度體系中，乙腈與水的混合輸送比例不固定，需要加熱攪拌(1)(如5-1所述)。對(duì)于分析過程中的在線脫氣，應(yīng)采用密封加壓的氦氣凈化系統(tǒng)。如果可能的話，最好保持恒溫。分析2×10 -6 RIUFS可能需要在一個(gè)恒溫控制的房間。

　　下一個(gè)要考慮的問題是加熱柱(或者更具體地說，抑制溫度的微小變化)。柱溫隨室內(nèi)空氣流動(dòng)而略有波動(dòng)。因此，這改變了-NH2基團(tuán)周圍水層的厚度，改變了柱洗脫液中的乙腈/水比例。在這種情況下，用三層汽泡紙(圖38)或使用其他方法來防止色譜柱暴露在直接氣流中，并抑制任何溫度變化。

　　即使柱溫箱開著，柱的位置等因素也會(huì)使柱暴露在風(fēng)扇氣流水平的變化中。這也適用于反相柱。

　　最后評(píng)論

　　正如我們所看到的到目前為止，流動(dòng)相適當(dāng)?shù)拿摎馐且环N有效抑制溶解在流動(dòng)相中的氣體造成的各種問題的方法，如在流路中形成氣泡或由于溶解空氣（或氧氣）水平的變化對(duì)檢測(cè)器造成不利影響。

　　直到最近，人們還普遍認(rèn)為，用抽濾器除氣，如引言所示，應(yīng)該總是進(jìn)行脫氣，但正如這篇文章所指出的，還有許多注意事項(xiàng)。因此，目前使用氣液分離膜進(jìn)行真空脫氣已經(jīng)非常流行，而氦氣脫氣用于更嚴(yán)格的脫氣應(yīng)用。

　　在某些特定的分析條件下，脫氣流動(dòng)相甚至?xí)?dǎo)致樣品溶劑中溶解空氣出現(xiàn)峰值。

　　我希望這篇文章將有助于所有的高效液相色譜用戶選擇和使用適合他們用途的脫氣方法。